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中 華 人 民 共 和 國(guó) 國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn)
GB4789. 35 — 2016
食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)
食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)
2016-12-23 發(fā)布 2017-06-23 實(shí)施
中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)
國(guó) 家 食 品 藥 品 監(jiān) 督 管 理 總 局
發(fā) 布
GB4789. 35 — 2016
Ⅰ
前 言
本 標(biāo) 準(zhǔn) 代 替 GB4789.35 — 2010 《食 品 安 全 國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn) 食 品 微 生 物 學(xué) 檢 驗(yàn) 乳 酸 菌 檢 驗(yàn)》、
SN / T1941. 1 — 2007 《進(jìn)出口食品中乳酸菌檢驗(yàn)方法 第 1 部分:分離與計(jì)數(shù)方法》。
本標(biāo)準(zhǔn)與 GB4789.
35 — 2010 相比,主要變化如下:
———增加了乳酸菌總數(shù)計(jì)數(shù)培養(yǎng)條件的選擇及結(jié)果說(shuō)明;
———修改了改良 MRS 培養(yǎng)基成分;
———修改了平板計(jì)數(shù)的接種方法和接種量。
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1
食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)
食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)
1  范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了含乳酸菌食品中乳酸菌(
lacticacidbacteria )的檢驗(yàn)方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的檢驗(yàn)。
2  術(shù)語(yǔ)和定義
2. 1
乳酸菌 lacticacidbacteria
一類可發(fā)酵糖主要產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的通稱。本標(biāo)準(zhǔn)中乳酸菌主要為乳桿菌屬(
Lactobacillus )、雙
歧桿菌屬(
Bifidobacterium )和嗜熱鏈球菌屬( Streptococcus )。
3  設(shè)備和材料
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下:
3. 1  恒溫培養(yǎng)箱: 36℃±1℃ 。
3. 2  冰箱: 2℃~5℃ 。
3. 3  均質(zhì)器及無(wú)菌均質(zhì)袋、均質(zhì)杯或滅菌乳缽。
3. 4  天平:感量 0. 01g 。
3. 5  無(wú)菌試管: 18mm×180mm 、 15mm×100mm 。
3. 6  無(wú)菌吸管: 1mL (具 0. 01mL 刻度)、 10mL (具 0. 1mL 刻度)或微量移液器及吸頭。
3. 7  無(wú)菌錐形瓶: 500mL 、 250mL 。
4  培養(yǎng)基和試劑
4. 1  生理鹽水:見(jiàn) A. 1 。
4. 2 MRS ( ManRogosaSharpe )培養(yǎng)基及莫匹羅星鋰鹽( Li-Mupirocin )和半胱氨酸鹽酸鹽( Cysteine
Hydrochloride )改良 MRS 培養(yǎng)基:見(jiàn) A. 2 和 A. 3 。
4. 3 MC 培養(yǎng)基( ModifiedChalmers 培養(yǎng)基):見(jiàn) A. 4 。
4. 4 0. 5% 蔗糖發(fā)酵管:見(jiàn) A. 5 。
4. 4 0. 5% 纖維二糖發(fā)酵管:見(jiàn) A. 5 。
4. 6 0. 5% 麥芽糖發(fā)酵管:見(jiàn) A. 5 。
4. 7 0. 5% 甘露醇發(fā)酵管:見(jiàn) A. 5 。
4. 8 0. 5% 水楊苷發(fā)酵管:見(jiàn) A. 5 。
4. 9 0. 5% 山梨醇發(fā)酵管:見(jiàn) A. 5 。
4. 10 0. 5% 乳糖發(fā)酵管:見(jiàn) A. 5 。
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2
4. 11  七葉苷發(fā)酵管:見(jiàn) A. 6 。
4. 12  革蘭氏染色液:見(jiàn) A. 7 。
4. 13  莫匹羅星鋰鹽( Li-Mupirocin ):化學(xué)純。
4. 14  半胱氨酸鹽酸鹽( CysteineHydrochloride ):純度 >99% 。
5  檢驗(yàn)程序
乳酸菌檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖 1 。
圖 1  乳酸菌檢驗(yàn)程序圖
6  操作步驟
6. 1  樣品制備
6. 1. 1  樣品的全部制備過(guò)程均應(yīng)遵循無(wú)菌操作程序。
6. 1. 2  冷凍樣品可先使其在 2℃~5℃ 條件下解凍,時(shí)間不超過(guò) 18h ,也可在溫度不超過(guò) 45℃ 的條件
解凍,時(shí)間不超過(guò) 15min 。
6. 1. 3  固體和半固體食品:以無(wú)菌操作稱取 25g 樣品,置于裝有 225mL 生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi),于
8000r / min~10000r / min 均質(zhì) 1min~2min ,制成 1∶10 樣品勻液;或置于 225mL 生理鹽水的無(wú)菌
均質(zhì)袋中,用拍擊式均質(zhì)器拍打 1min~2min 制成 1∶10 的樣品勻液。
6. 1. 4  液體樣品:液體樣品應(yīng)先將其充分搖勻后以無(wú)菌吸管吸取樣品 25mL 放入裝有 225mL 生理鹽
水的無(wú)菌錐形瓶(瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠)中,充分振搖,制成 1∶10 的樣品勻液。
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6. 2  步驟
6. 2. 1  用 1mL 無(wú)菌吸管或微量移液器吸取 1∶10 樣品勻液 1mL ,沿管壁緩慢注于裝有 9mL 生理鹽
水的無(wú)菌試管中(注意吸管尖端不要觸及稀釋液),振搖試管或換用 1 支無(wú)菌吸管反復(fù)吹打使其混合均
勻,制成 1∶100 的樣品勻液。
6. 2. 2  另取 1mL 無(wú)菌吸管或微量移液器吸頭,按上述操作順序,做 10 倍遞增樣品勻液,每遞增稀釋
一次,即換用 1 次 1mL 滅菌吸管或吸頭。
6. 2. 3  乳酸菌計(jì)數(shù)
6. 2. 3. 1  乳酸菌總數(shù)
乳酸菌總數(shù)計(jì)數(shù)培養(yǎng)條件的選擇及結(jié)果說(shuō)明見(jiàn)表 1 。
表 1  乳酸菌總數(shù)計(jì)數(shù)培養(yǎng)條件的選擇及結(jié)果說(shuō)明
樣品中所包括乳酸菌菌屬 培養(yǎng)條件的選擇及結(jié)果說(shuō)明
僅包括雙歧桿菌屬 按 GB4789.
34 的規(guī)定執(zhí)行
僅包括乳桿菌屬 按照 6.
2. 3. 4 操作。結(jié)果即為乳桿菌屬總數(shù)
僅包括嗜熱鏈球菌 按照 6.
2. 3. 3 操作。結(jié)果即為嗜熱鏈球菌總數(shù)
同時(shí)包括雙歧桿菌屬和乳桿菌屬
1 ) 按照 6. 2. 3. 4 操作。結(jié)果即為乳酸菌總數(shù);
2 ) 如需單獨(dú)計(jì)數(shù)雙歧桿菌屬數(shù)目,按照 6. 2. 3. 2 操作
同時(shí)包括雙歧桿菌屬和嗜熱鏈球菌
1 ) 按照 6. 2. 3. 2 和 6. 2. 3. 3 操作,二者結(jié)果之和即為乳酸菌總數(shù);
2 ) 如需單獨(dú)計(jì)數(shù)雙歧桿菌屬數(shù)目,按照 6. 2. 3. 2 操作
同時(shí)包括乳桿菌屬和嗜熱鏈球菌
1 ) 按照 6. 2. 3. 3 和 6. 2. 3. 4 操作,二者結(jié)果之和即為乳酸菌總數(shù);
2 ) 6. 2. 3. 3 結(jié)果為嗜熱鏈球菌總數(shù);
3 ) 6. 2. 3. 4 結(jié)果為乳桿菌屬總數(shù)
同時(shí)包括 雙歧 桿菌 屬,乳 桿菌 屬和 嗜 熱鏈
球菌
1 ) 按照 6. 2. 3. 3 和 6. 2. 3. 4 操作,二者結(jié)果之和即為乳酸菌總數(shù);
2 ) 如需單獨(dú)計(jì)數(shù)雙歧桿菌屬數(shù)目,按照 6. 2. 3. 2 操作
6. 2. 3. 2  雙歧桿菌計(jì)數(shù)
根據(jù)對(duì)待檢樣品雙歧桿菌含量的估計(jì),選擇 2 個(gè) ~3 個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度,每個(gè)稀釋度吸取 1mL
樣品勻液于滅菌平皿內(nèi),每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。稀釋液移入平皿后,將冷卻至 48℃ 的莫匹羅星鋰鹽
和半胱氨酸鹽酸鹽改良的 MRS 培養(yǎng)基傾注入平皿約 15mL ,轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使混合均勻。 36 ℃±1 ℃ 厭氧
培養(yǎng) 72h±2h ,培養(yǎng)后計(jì)數(shù)平板上的所有菌落數(shù)。從樣品稀釋到平板傾注要求在 15min 內(nèi)完成。
6. 2. 3. 3  嗜熱鏈球菌計(jì)數(shù)
根據(jù)待檢樣品嗜熱鏈球菌活菌數(shù)的估計(jì),選擇 2 個(gè) ~3 個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度,每個(gè)稀釋度吸取
1mL 樣品勻液于滅菌平皿內(nèi),每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。稀釋液移入平皿后,將冷卻至 48℃ 的 MC 培
養(yǎng)基傾注入平皿約 15mL ,轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使混合均勻。 36℃±1℃ 需氧培養(yǎng) 72h±2h ,培養(yǎng)后計(jì)數(shù)。嗜熱
鏈球菌在 MC 瓊脂平板上的菌落特征為:菌落中等偏小,邊緣整齊光滑的紅色菌落,直徑 2mm±1mm ,菌
落背面為粉紅色。從樣品稀釋到平板傾注要求在 15min 內(nèi)完成。
6. 2. 3. 4  乳桿菌計(jì)數(shù)
根據(jù)待檢樣品活菌總數(shù)的估計(jì),選擇 2 個(gè) ~3 個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度,每個(gè)稀釋度吸取 1mL 樣品勻
液于滅菌平皿內(nèi),每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。稀釋液移入平皿后,將冷卻至 48℃ 的 MRS 瓊脂培養(yǎng)基傾
注入平皿約 15mL ,轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使混合均勻。 36℃±1℃ 厭氧培養(yǎng) 72h±2h 。從樣品稀釋到平板傾注要
求在 15min 內(nèi)完成。
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6. 3  菌落計(jì)數(shù)
注:可用肉眼觀察,必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器,記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位
(
colony-formingunits , CFU )表示。
6. 3. 1  選取菌落數(shù)在 30CFU~300CFU 之間、無(wú)蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于 30CFU
的平板記錄具體菌落數(shù),大于 300CFU 的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的
平均數(shù)。
6. 3. 2  其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí),則不宜采用,而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋
度的菌落數(shù);若片狀菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均勻,即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以
2 ,代表一個(gè)平板菌落數(shù)。
6. 3. 3  當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無(wú)明顯界線的鏈狀生長(zhǎng)時(shí),則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。
6. 4  結(jié)果的表述
6. 4. 1  若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi),計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值,再將平
均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù),作為每克或每毫升中菌落總數(shù)結(jié)果。
6. 4. 2  若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí),按式( 1 )計(jì)算:
N =
∑ C
(
n 1 +0. 1 n 2 ) d
……………………………( 1 )
式中:
N ———樣品中菌落數(shù);
∑ C ———平板(含適宜范圍菌落數(shù)的平板)菌落數(shù)之和;
n 1
———第一稀釋度(低稀釋倍數(shù))平板個(gè)數(shù);
n 2
———第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))平板個(gè)數(shù);
d
———稀釋因子(第一稀釋度)。
6. 4. 3  若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于 300CFU ,則對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù),其他平板可
記錄為多不可計(jì),結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。
6. 4. 4  若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于 30CFU ,則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)
計(jì)算。
6. 4. 5  若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無(wú)菌落生長(zhǎng),則以小于 1 乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。
6. 4. 6  若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在 30CFU~300CFU 之間,其中一部分小于 30CFU 或大于
300CFU 時(shí),則以最接近 30CFU 或 300CFU 的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。
6. 5  菌落數(shù)的報(bào)告
6. 5. 1  菌落數(shù)小于 100CFU 時(shí),按“四舍五入”原則修約,以整數(shù)報(bào)告。
6. 5. 2  菌落數(shù)大于或等于 100CFU 時(shí),第 3 位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后,取前 2 位數(shù)字,后面用
0 代替位數(shù);也可用 10 的指數(shù)形式來(lái)表示,按“四舍五入”原則修約后,采用兩位有效數(shù)字。
6. 5. 3  稱重取樣以 CFU / g 為單位報(bào)告,體積取樣以 CFU / mL 為單位報(bào)告。
7  結(jié)果與報(bào)告
根據(jù)菌落計(jì)數(shù)結(jié)果出具報(bào)告,報(bào)告單位以 CFU / g ( mL )表示。
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8  乳酸菌的鑒定(可選做)
8. 1  純培養(yǎng)
挑取 3 個(gè)或以上單個(gè)菌落,嗜熱鏈球菌接種于 MC 瓊脂平板,乳桿菌屬接種于 MRS 瓊脂平板,置
36℃±1℃ 厭氧培養(yǎng) 48h 。
8. 2  鑒定
8. 2. 1  雙歧桿菌的鑒定按 GB4789. 34 的規(guī)定操作。
8. 2. 2  涂片鏡檢:乳桿菌屬菌體形態(tài)多樣,呈長(zhǎng)桿狀、彎曲桿狀或短桿狀。無(wú)芽胞,革蘭氏染色陽(yáng)性。
嗜熱鏈球菌菌體呈球形或球桿狀,直徑為 0.
5 μ m~2. 0 μ m ,成對(duì)或成鏈排列,無(wú)芽胞,革蘭氏染色陽(yáng)性。
8. 2. 3  乳酸菌菌種主要生化反應(yīng)見(jiàn)表 2 和表 3 。
表 2  常見(jiàn)乳桿菌屬內(nèi)種的碳水化合物反應(yīng)
菌種 七葉苷 纖維二糖 麥芽糖 甘露醇 水楊苷 山梨醇 蔗糖 棉子糖
干酪乳 桿 菌 干 酪 亞 種 ( L .
casei subsp.
casei )
+ + + + + + + -
德氏乳桿菌保加利亞種( L .
delbrueckii
subsp. bulgaricus )
- - - - - - - -
嗜酸乳桿菌( L .
acidophilus ) + + + - + - + d
羅伊氏乳桿菌( L .
reuteri ) ND - + - - - + +
鼠李糖乳桿菌( L .
rhamnosus ) + + + + + + + -
植物乳桿菌( L .
plantarum )
+ + + + + + + +
注: + 表示 90% 以上菌株陽(yáng)性; - 表示 90% 以上菌株陰性; d 表示 11%~89% 菌株陽(yáng)性; ND 表示未測(cè)定。
表 3  嗜熱鏈球菌的主要生化反應(yīng)
菌種 菊糖 乳糖 甘露醇 水楊苷 山梨醇 馬尿酸 七葉苷
嗜熱鏈球菌(
S . thermophilus ) - + - - - - -
注: + 表示 90% 以上菌株陽(yáng)性; - 表示 90% 以上菌株陰性。
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附 錄 A
培養(yǎng)基及試劑
A. 1  生理鹽水
A. 1. 1  成分
NaCl 8. 5g
A. 1. 2  制法
將上述成分加入到 1000mL 蒸餾水中,加熱溶解,分裝后 121℃ 高壓滅菌 15min~20min 。
A. 2 MRS 培養(yǎng)基
A. 2. 1  成分
蛋白胨
10. 0g
牛肉粉
5. 0g
酵母粉
4. 0g
葡萄糖
20. 0g
吐溫 80
1. 0mL
K 2 HPO 4 · 7H 2 O 2. 0g
醋酸鈉· 3H 2 O
5. 0g
檸檬酸三銨
2. 0g
MgSO 4 · 7H 2 O 0. 2g
MnSO 4 · 4H 2 O 0. 05g
瓊脂粉
15. 0g
A. 2. 2  制法
將上述成分加入到 1000mL 蒸餾水中,加熱溶解,調(diào)節(jié)
pH
至 6.
2±0. 2 ,分裝后 121 ℃ 高壓滅菌
15min~20min 。
A. 3  莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽改良 MRS 培養(yǎng)基
A. 3. 1  莫匹羅星鋰鹽儲(chǔ)備液制備:稱取 50mg 莫匹羅星鋰鹽加入到 50mL 蒸餾水中,用 0. 22 μ m 微孔
濾膜過(guò)濾除菌。
A. 3. 2  半胱氨酸鹽酸鹽儲(chǔ)備液制備:稱取 250mg 半胱氨酸鹽酸鹽加入到 50mL 蒸餾水中,用 0. 22 μ m 微
孔濾膜過(guò)濾除菌。
A. 3. 3  制法
將 A.
2. 1 成分加入到 950mL 蒸餾水中,加熱溶解,調(diào)節(jié)
pH
,分裝后 121℃ 高壓滅菌 15min~20min 。
臨用時(shí)加熱熔化瓊脂,在水浴中冷至 48℃ ,用帶有 0.
22 μ m 微孔濾膜的注射器將莫匹羅星鋰鹽儲(chǔ)備液
及半胱氨酸鹽酸鹽儲(chǔ)備液制備加入到熔化瓊脂中,使培養(yǎng)基中莫匹羅星鋰鹽的濃度為 50 μ g / mL ,半胱
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氨酸鹽酸鹽的濃度為 500 μ g / mL 。
A. 4 MC 培養(yǎng)基
A. 4. 1  成分
大豆蛋白胨
5. 0g
牛肉粉
3. 0g
酵母粉
3. 0g
葡萄糖
20. 0g
乳糖
20. 0g
碳酸鈣
10. 0g
瓊脂
15. 0g
蒸餾水
1000mL
1% 中性紅溶液 5. 0mL
A. 4. 2  制法
將前面 7 種成分加入蒸餾水中,加熱溶解,調(diào)節(jié)
pH
至 6.
0±0. 2 ,加入中性紅溶液。分裝后 121 ℃
高壓滅菌 15min~20min 。
A. 5  乳酸桿菌糖發(fā)酵管
A. 5. 1  基礎(chǔ)成分
牛肉膏
5. 0g
蛋白胨
5. 0g
酵母浸膏
5. 0g
吐溫 80
0. 5mL
瓊脂
1. 5g
1. 6% 溴甲酚紫酒精溶液 1. 4mL
蒸餾水
1000mL
A. 5. 2  制法
按 0.
5% 加入所需糖類,并分裝小試管, 121℃ 高壓滅菌 15min~20min 。
A. 6  七葉苷培養(yǎng)基
A. 6. 1  成分
蛋白胨
5. 0g
磷酸氫二鉀
1. 0g
七葉苷
3. 0g
枸櫞酸鐵
0. 5g
1. 6% 溴甲酚紫酒精溶液 1. 4mL
蒸餾水
100mL
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A. 6. 2  制法
將上述成分加入蒸餾水中,加熱溶解,
121℃ 高壓滅菌 15min~20min 。
A. 7  革蘭氏染色液
A. 7. 1  結(jié)晶紫染色液
A. 7. 1. 1  成分
結(jié)晶紫
1. 0g
95% 乙醇 20mL
1% 草酸銨水溶液 80mL
A. 7. 1. 2  制法
將結(jié)晶紫完全溶解于乙醇中,然后與草酸銨溶液混合。
A. 7. 2  革蘭氏碘液
A. 7. 2. 1  成分
碘
1. 0g
碘化鉀
2. 0g
蒸餾水
300mL
A. 7. 2. 2  制法
將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合,加入蒸餾水少許充分振搖,待完全溶解后,再加蒸餾水至 300mL 。
A. 7. 3  沙黃復(fù)染液
A. 7. 3. 1  成分
沙黃
0. 25g
95% 乙醇 10mL
蒸餾水
90mL
A. 7. 3. 2  制法
將沙黃溶解于乙醇中,然后用蒸餾水稀釋。
A. 7. 4  染色法
A. 7. 4. 1  將涂片在酒精燈火焰上固定,滴加結(jié)晶紫染色液,染 1min ,水洗。
A. 7. 4. 2  滴加革蘭氏碘液,作用 1min ,水洗。
A. 7. 4. 3  滴加 95% 乙醇脫色,約 15s~30s ,直至染色液被洗掉,不要過(guò)分脫色,水洗。
A. 7. 4. 4  滴加復(fù)染液,復(fù)染 1min 。水洗、待干、鏡檢。