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新型雙堿基編輯器助力基因飽和突變文庫構建
作者：朱漢斌 來源：中國科學報
山東拓普生物工程有限公司  http://www.jlkcpj.cn
新型雙堿基編輯器AGBE工作原理圖。課題組 供圖
近日，中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院研究員賴良學課題組在新型堿基編輯器開發(fā)方面取得重要進展，獲得了可同時兼具當前多種單堿基編輯器及CRISPR/Cas9基因編輯功能的多功能堿基編輯器，可廣泛地誘導產(chǎn)生多種模式的突變，對于飽和突變文庫構建、基因突變功能研究等方面具有重要促進作用。相關研究在線發(fā)表于《核酸研究》（Nucleic Acids Research）。
基因單核苷酸變異（SNV）與基因功能密切相關�；�于日漸普及的高通量測序技術，研究人員在動植物乃至人類基因組中發(fā)現(xiàn)了大量的SNVs。這些細微的基因差異中的部分已經(jīng)被證實與動植物的性狀變異相關，也與人類遺傳疾病的發(fā)生發(fā)展或藥物療效存在密切聯(lián)系。但是目前仍有大量SNV的功能尚未得到明確，如何揭示這些遺傳變異與物種性狀及臨床表型間的關聯(lián)，是農業(yè)分子育種和精準醫(yī)學研究等領域向前推進時亟需解決的瓶頸。
基因飽和突變文庫是研究基因SNV功能的重要工具。利用基因編輯技術在基因特定區(qū)域中引入不同類型的堿基突變，并以其為基礎進行功能性篩選，可以實現(xiàn)基因SNV功能的高通量研究。
近年來，基因突變文庫構建主要借助CRISPR/Cas9系統(tǒng)在目標區(qū)域內引入移碼突變破壞基因表達，從而根據(jù)表型鑒定基因功能。這種方式也可以誘導基因SNV的產(chǎn)生，但是效率極其低下，不適合用于與基因SNVs相關的飽和突變文庫的高效構建。David Liu實驗室開發(fā)的堿基編輯器（BE）為飽和文庫的構建帶來了技術上的突破。BE系統(tǒng)可以在基因特定區(qū)域引入高效的單堿基轉換，因此被迅速應用于與DNA損傷應答或癌癥相關的基因SNVs功能的高通量篩選等研究中，并取得了突破性的成果。但現(xiàn)有的BE只能實現(xiàn)一種或兩種類型的堿基轉換，不能滿足飽和突變文庫對編輯產(chǎn)物多樣性的需求，因此，亟需建立可以誘導多種類型堿基轉換的基因編輯工具。
該研究將腺嘌呤堿基編輯器（ABE）和糖苷酶堿基編輯器（CGBE）結合，開發(fā)出一種新型的雙堿基編輯器——AGBE。它可以利用單個向導RNA（sgRNA）誘導同一等位基因的靶序列單獨或同時發(fā)生包括A-to-G、C-to-G、C-to-T和C-to-A等4種不同類型的堿基轉換。隨后，研究人員在永生化細胞系、原代細胞和胚胎細胞等多個哺乳動物的細胞體系中驗證了AGBE系統(tǒng)的有效性。結果表明，與單獨的ABE和CGBE相比，AGBE極大地拓寬編輯窗口（從4-8到3-13），在此基礎上通過將不同類型的堿基轉換進行組合，可以大幅度地增加編輯產(chǎn)物的多樣性，從而構建出含有更多基因突變類型的突變文庫。令人驚喜的是，研究人員通過分析全基因組和轉錄組測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)AGBE并不會引起明顯的DNA或RNA水平的脫靶效應，證明了該系統(tǒng)是一款高效且安全的堿基編輯工具。
研究人員挑選了人類白喉毒素受體基因hDTR用于驗證AGBE在基因飽和突變文庫構建中的應用潛能。當hDTR基因發(fā)生突變時，會改變人類細胞對白喉毒素的敏感性，結合白喉毒素篩選和富集，可以快速獲得具有白喉毒素抗性的突變文庫，從而分析hDTR基因的SNV與藥物敏感性間的聯(lián)系。研究結果表明，在針對hDTR基因的關鍵功能域設計的32條sgRNA中，有20條可以賦予細胞抵抗白喉毒素的能力，產(chǎn)生了多達59269種不同類型的等位基因突變產(chǎn)物，并從中篩選出對白喉毒素有不同敏感性的突變細胞株。以上結果充分證實了利用AGBE系統(tǒng)進行基因SNVs功能高通量研究的可行性和高效性。
在本項研究中，賴良學課題組梁艷慧博士、謝精科博士、張全軍助理研究員和王曉民博士為該論文共同第一作者，賴良學研究員和王可品副研究員為共同通訊作者。該研究工作得到了國家自然科學基金、國家重點研發(fā)計劃、廣東省科技計劃、中國科學院青年創(chuàng)新促進會和中國科協(xié)青年人才托舉工程等項目的資助。
相關論文信息：https://doi.org/10.1093/nar/gkac353