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山東拓普生物工程有限公司

Shandong Tuopu Biol-Engineering Co.,Ltd

ICS 07.100.30
C 53
中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)
GB/T 4789.32—2002
食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)
大腸菌群的快速檢測
Microbiological examination of food hygiene—
Rapid detection of Coliform bacteria
2002-06-13發(fā)布  2002-10-01 實(shí)施
國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局
發(fā)布
GB/T 4789.32—2002
I
前 言
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中大腸菌群的快速檢驗(yàn)方法。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定使用的培養(yǎng)基MUGal肉湯中的 4-甲基
傘型酮-β-D-半乳糖苷與美國聯(lián)邦法規(guī) 40，第 141節(jié)，21 款(Code of Federal Regul ati ons 40, Part
141.21)規(guī)定的檢驗(yàn)大腸菌群所用的MI 瓊脂的主要成分(4-甲基傘型酮-β-D-半乳糖苷)是同一物質(zhì)。
本標(biāo)準(zhǔn)關(guān)于大腸菌群的菌落計(jì)數(shù)，參考了I SO 4832: 1999(E)《微生物學(xué)-大腸菌群菌落計(jì)數(shù)法通則》
(Microbi ol ogy-General Gui dance for the enumerati on of col i forms-colony count technique)。
本標(biāo)準(zhǔn)中的附錄 A是規(guī)范性附錄。
本標(biāo)準(zhǔn)由國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局提出并歸口。
本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：鎮(zhèn)江出入境檢驗(yàn)檢疫局，中國標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)，鎮(zhèn)江質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局。
本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：甄宏太、李平、張秀春、閔繼福。
GB/T 4789.32—2002
II
引 言
大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸或醛，并產(chǎn)生β-半乳糖苷酶需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無
芽孢桿菌。該菌主要來源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標(biāo)來評(píng)價(jià)食品的衛(wèi)生質(zhì)量，推斷食品中有
否污染腸道致病菌的可能。如果大腸菌群存在于食品中，表明未做有效的消毒處理、加工后保存條件不
良或消毒后又受到污染�？焖贆z驗(yàn)這些細(xì)菌，有助于食品的衛(wèi)生管理，維護(hù)消費(fèi)者的食用安全。
GB/T 4789.32—2002
1
食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)
大腸菌群的快速檢測
1 范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中大腸菌群的快速檢驗(yàn)和計(jì)數(shù)方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中大腸菌群的快速檢驗(yàn)和計(jì)數(shù)。
2 規(guī)范性引用文件
下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的
修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究
是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。
GB 4789.3 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群測定
GB 4789.28 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 染色法培養(yǎng)基和試劑
I SO 4832: 1991(E) 微生物學(xué)-大腸菌群菌落計(jì)數(shù)法通則
3 術(shù)語和定義
下列屬于和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)
3.1
3.2 大腸菌群 Colifrom bacteria
大腸菌群是革蘭氏陰性、無芽孢、氧化酶陰性的桿狀細(xì)菌，為需氧和兼性厭氧，可在有膽鹽（或具
有其他抑制生長的表面活性劑）存在的情況下生長，通�？稍�36℃±2℃發(fā)酵乳糖并產(chǎn)酸和醛。具有β-
半乳糖苷酶。在本標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定的條件下，大腸菌群為能分解β-半乳糖苷，使培養(yǎng)基發(fā)出熒光或生成紫色
（或紅色）菌落的一群革蘭氏陰性無芽孢桿菌。
4 原理
4.1 最可能數(shù)(MPN)法
大腸菌群可產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，分解液體培養(yǎng)集中的酶底物——4-甲基傘型酮-β-D-半乳糖苷（以
下簡稱MUGal）,使4-甲基傘型酮游離，因而在366nm的紫外光燈下呈現(xiàn)藍(lán)色熒光。
4.2 平板法
大腸菌群可產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，分解培養(yǎng)集中的酶底物--茜素-β-D半乳糖苷（以下簡稱Al iz-gal ）,
使茜素游離并與固體培養(yǎng)基中的鋁、鉀、鐵、銨離子結(jié)合形成紫色（或紅色）的螯合物，使菌落呈現(xiàn)相
應(yīng)的顏色。
5 試劑和培養(yǎng)基
5.1 磷酸鹽緩沖液
按 GB 4789.28-1994 中3.22規(guī)定進(jìn)行制備。
5.2 生理鹽水
5.2.1 成分
氯化鈉 8.5g
GB/T 4789.32—2002
2
蒸餾水 1 000mL
5.2.2 制法
將氯化鈉溶于蒸餾水，121℃蒸汽滅菌15mi n。
5.3 MUGal肉湯
5.3.1 成分
胰蛋白胨或胰酪胨  20.0g
氯化鈉 5.0g
無水磷酸氫二鉀 2.75g
無水磷酸二氫鉀 2.75g
月桂基硫酸鈉  0.1g
MUGal (純度不低于99%)  0.08g
蒸餾水 1 000mL
5.3.2 制法
將各成分加熱溶于蒸餾水中，以 15％～20％氫氧化鈉溶液調(diào)整 pH 值，分裝于 20 mm×150 mm試
管，每管 9 mL，116℃蒸汽滅菌10 min，最終pH值7.0～7.2。待培養(yǎng)基冷卻后，以無菌手續(xù)于每管培養(yǎng)
液內(nèi)加入 0.1 mL 經(jīng)無菌水稀釋的 500 μg/mL 頭孢磺定液或于 1000mL 滅菌培養(yǎng)液內(nèi)加 1 mL經(jīng)無菌
水稀釋的5 mg/mL頭孢磺啶液并以無菌操作分裝試管。
注： 雙料的MUGal 肉湯除蒸餾水外其他成分加倍
5.4 Aliz-gal瓊脂
5.4.1 成分
胰蛋白胨或胰酪胨  20.0g
氯化鈉 5.0g
無水磷酸氫二鉀 2.75g
無水磷酸二氫鉀 2.75g
月桂基硫酸鈉  0.1g
Al iz-gal （純度不低于97%）  0.05g
異丙基硫代半乳糖苷 0.03g
硫酸鋁鉀  0.5g
檸檬酸鐵銨 0.5g
瓊脂  15.0g
蒸餾水 1 000mL
5.4.2 制法
將各成分放入蒸餾水中，加熱使溶化，以15％～20％ NaOH 調(diào)整pH值，分裝燒瓶，116℃蒸汽滅菌
10mi n，最終pH值 7.0～7.2。
6 設(shè)備和器材
6.1 培養(yǎng)箱：37 ℃ ± 1℃。
6.2 冷藏箱：0 ℃ ± 4℃。
6.3 天平：感量 0.01g。
6.4 均質(zhì)器或乳缽。
6.5 平皿：直徑90mm。
6.6 試管：20mm x 150 mm。
6.7 吸管：1.0mL 和 10.0mL。
GB/T 4789.32—2002
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6.8 廣口瓶或三角瓶：容量 500mL。
6.9 玻璃珠：直徑約5mm。
6.10 試管架。
6.11 紫外燈（波長 366nm）。
6.12 其他。
7 檢驗(yàn)程序
見圖1。
圖1 檢驗(yàn)程序
8 樣品的制備
8.1 以無菌手續(xù)取 25mL（或 25g）樣品，加于含225 mL 無菌磷酸鹽緩沖液（或生理鹽水）的廣口瓶（或
三角瓶）內(nèi)（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠），充分振搖或用均質(zhì)器以 8 000 r/m～10 000 r/m均質(zhì)1 mi n
成 1∶10稀釋液。
8.2 用1mL 無菌吸管吸取 1∶10 樣品稀釋液 1.0mL，注入含 9.0 mL 無菌磷酸鹽緩沖液（或生理鹽水）
的試管內(nèi)。振搖均勻，即成 1∶100 樣品稀釋液。
8.3 另取 1.0 mL無菌吸管，按上法制備 10倍遞增樣品稀釋液。每遞增一次，換一支 1.0 mL 無菌吸管。
8.4 根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)�樣品污染程度的估�?jì)，選擇三個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種
三管培養(yǎng)基（MPN法）或兩個(gè)平皿（平板法）。
9 大腸菌群的 MPN 計(jì)數(shù)
9.1 將待檢樣品和樣品稀釋液接種MUGal 肉湯管，每管1.0 mL(接種量在1.0 mL以上者，接種雙料MUGal
肉湯管)，每個(gè)樣品接種三個(gè)連續(xù)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種 3 管培養(yǎng)基。同時(shí)另取 2 支 MUGal 肉湯管（或
雙料 MUGal 肉湯管）加入與樣品稀釋液等量的上述無菌磷酸鹽緩沖液（或生理鹽水）作空白對(duì)照。
9.2 將接種后的培養(yǎng)管置于 37 ℃ ± 1℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 18～24h。
檢樣
稀釋
在波長 366nm 紫外燈
下置暗處觀察
Aliz-gal 瓊脂(平板法)
37 ℃ ± 1℃ 18~24h
計(jì)數(shù)紫色(或紅色)菌落
報(bào)告
有熒光  無熒光
MUGal 肉湯(MPN 法)
37 ℃ ± 1℃ 18~24h
大腸菌群陰性  大腸菌群陽性
報(bào)告  報(bào)告
GB/T 4789.32—2002
4
9.3 將培養(yǎng)管置于暗處，用波長 366nm的紫外光燈照射，如顯藍(lán)色熒光，為大腸菌群陽性管；如未顯
藍(lán)色熒光，則為大腸菌群陰性管。
9.4 結(jié)果報(bào)告：根據(jù)大腸菌群陽性管數(shù)，查MPN表（見附錄 A）,報(bào)告每 100mL（g）食品中大腸菌群
MPN值。
10 大腸菌群的菌落計(jì)數(shù)
10.1 用滅菌吸管吸取待檢樣液 1.0mL，加入無菌平皿內(nèi)。每個(gè)樣品接種三個(gè)連續(xù)稀釋度，每個(gè)稀釋度
接種兩個(gè)平皿。
10.2 于每個(gè)加樣平皿內(nèi)傾注 15mL 45℃～50℃ 的 Al iz-gal 瓊脂，迅速輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使混合均勻。
待瓊脂凝固后，再傾注 3mL～5mL Al i z-gal 瓊脂覆蓋表面。同時(shí)將 Al i z-gal 瓊脂傾入加有 1mL 上述無
菌磷酸鹽緩沖液（或生理鹽水）的無菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。
10.3 待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，于 37 ℃ ± 1℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24h。取出平板，計(jì)數(shù)紫色（或紅
色）菌落。
10.4 結(jié)果報(bào)告
10.4.1 當(dāng)平板上的紫色（或紅色）菌落數(shù)不高于 150 個(gè)，且其中至少有一個(gè)平板紫色（或紅色）菌落
不少于 15 個(gè)時(shí)，按式（1）計(jì)算大腸菌群數(shù)：
d n n
C
N
) 2 1 ( +
∑
=
⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯（1）
式中：
N——樣品的大腸菌群數(shù)，個(gè)/mL或g；
∑C——所有計(jì)數(shù)平板上，紫色（或紅色）菌落數(shù)之總和；
n1——供計(jì)數(shù)的最低稀釋倍數(shù)的平板數(shù)；
n2——供計(jì)數(shù)的高一倍數(shù)的平板數(shù)；
d——供計(jì)數(shù)的樣品最低稀釋度（如10
-1 , 10 -2 , 10 -3 等）。
10.4.2 如接種所有（3 個(gè)）稀釋樣品的平板上紫色（或紅色）菌落數(shù)均少于 15個(gè)時(shí)，仍按式（1）計(jì)
算，但應(yīng)在所得結(jié)果旁加“*”號(hào)，表示為估計(jì)值。
10.4.3 如接種未稀釋樣品和所有稀釋樣品的平板上，紫色（或紅色）菌落數(shù)均少于 15 個(gè)時(shí)，報(bào)告結(jié)
果為：每毫升（克）樣品少于 15 個(gè)大腸菌群。
10.4.4 如接種未稀釋樣品和所有稀釋樣品的平板上，均未發(fā)現(xiàn)紫色（或紅色）菌落數(shù)時(shí)，報(bào)告結(jié)果為：
每毫升（克）樣品少于 1 個(gè)大腸菌群。
10.4.5 如平板上的紫色（或紅色）菌落數(shù)高于 150個(gè)時(shí)，按式(1)計(jì)算，在結(jié)果旁加“*”號(hào)表示估計(jì)
值或視情況重新選擇較高的稀釋倍數(shù)進(jìn)行測定。
GB/T 4789.32—2002
5
附 錄 A
（規(guī)范性附錄）
大腸菌群最可能數(shù)(MPN)檢索表
表 A.1
陽性管數(shù)  95%可信限
1 mL(g)x3  0.1mL(g) x 3  0.01mL(g)x3
MPN 100 mL(g)
下限  上限
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
2
3
<30
30
60
90
＜5  90
0
0
0
0
1
1
1
1
0
1
2
3
30
60
90
120
＜5  130
0
0
0
0
2
2
2
2
0
1
2
3
60
90
120
160
-  -
0
0
0
0
3
3
3
3
0
1
2
3
90
130
160
190
-  -
1
1
1
1
0
0
0
0
0
1
2
3
40
70
110
150
＜5
10
200
210
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
2
3
70
110
150
190
10
30
200
210
1
1
1
1
2
2
2
2
0
1
2
3
110
150
200
240
30  360
1
1
1
1
3
3
3
3
0
1
2
3
160
200
240
290
-  -
2
2
2
2
0
0
0
0
0
1
2
3
90
140
200
260
10
30
360
370
GB/T 4789.32—2002
6
表 A.1（續(xù)）
陽性管數(shù)  95%可信限
1 mL(g)x3  0.1mL(g) x 3  0.01mL(g)x3
MPN 100 mL(g)
下限  上限
2
2
2
2
1
1
1
1
0
1
2
3
150
200
270
340
30
70
440
890
2
2
2
2
2
2
2
2
0
1
2
3
210
280
350
420
40
100
470
1 500
2
2
2
2
3
3
3
3
0
1
2
3
290
360
440
530
-  -
3
3
3
3
0
0
0
0
0
1
2
3
230
390
640
950
40
70
150
1 200
1 300
3 800
3
3
3
3
1
1
1
1
0
1
2
3
430
750
1 200
1 600
70
140
300
2 100
2 300
3 800
3
3
3
3
2
2
2
2
0
1
2
3
930
1 500
2 100
2 900
150
300
350
3 800
4 400
4 700
3
3
3
3
3
3
3
3
0
1
2
3
2 400
4 600
11 000
≥24 000
360
710
1 500
13 000
24 000
48 000
注 1：本表采用 3 個(gè)稀釋度[ 1mL(g)、0.1mL(g)和0.01mL(g)], 每稀釋度 3管。
注 2：表內(nèi)所列檢樣量如改用 10mL(g)、1mL(g)和 0.1mL(g)時(shí)，表內(nèi)數(shù)字相應(yīng)降低 10 倍；如改用0.1mL(g)、
0.01mL(g)和 0.001mL(g)時(shí)，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增加 10 倍，其余可類推。