近年來，CRISPR/Cas介導的植物基因組定點編輯技術在農(nóng)作物基因功能研究和精準育種中發(fā)揮了重要作用，展現(xiàn)了廣闊的發(fā)展?jié)摿�和應用前景。然而，CRISPR/Cas介導的植物基因組定點敲除技術只能在基因組特定位點產(chǎn)生隨機插入和刪除，精準的片段插入和替換的效率一直很低，極大地限制了其在植物研究和育種上的應用。因此，迫切需要建立更高效的植物基因組片段插入和替換技術體系。

由中國科院上海植物逆境生物學研究中心/中國科學院上海分子植物科學卓越創(chuàng)新中心朱健康院士領銜的研究團隊在植物基因組編輯領域再次取得重要進展。研究人員采用修飾后的DNA片段作為供體，在水稻上建立了一種高效的片段靶向敲入和替換技術，高至50%的靶向敲入效率將極大地方便植物的研究和育種。

植物基因組編輯是朱健康實驗室的重點研究領域，他們在近幾年來獲得了一系列的進展。作為該領域的重大難題，片段的靶向敲入和替換一直是他們的一個重要研究目標，也一直在圍繞這一目標努力。在成功地建立了病毒介導的同源重組（HDR）和各類單堿基編輯技術等多種方法的同時，他們也開始嘗試在供體DNA片段上尋找突破點，以克服現(xiàn)有方法效率低、應用范圍窄等缺陷。核酸修飾在人的RNAi療法和核酸疫苗等醫(yī)學領域有廣泛的應用。

朱健康課題組通過嘗試，發(fā)現(xiàn)將供體片段同時進行硫代修飾和磷酸化修飾后，能極大地增強CRISPR/Cas9引導的靶向敲入效率。他們先后在14個基因位點上成功靶向敲入了各類調(diào)控元件，包括翻譯增強子、轉錄調(diào)控元件，甚至整個啟動子，供體片段最長達2049bp。通過對1393株各類T0代基因編輯水稻植株的分析發(fā)現(xiàn)，該方法的敲入效率可高達47.3%，平均效率為25%。高效的敲入效率甚至可以同時在四個位點上實現(xiàn)多基因靶向敲入�？梢灶A計，該技術的建立將使靶向敲入成為一項和靶向敲除一樣的常規(guī)實驗，被各個植物研究和育種單位廣泛應用。
在此基礎上，朱健康研究團隊又巧妙地設計了一種片段精準替換的策略，稱之為重復片段介導的同源重組（TR-HDR）方法。常規(guī)的HDR頻率極其低下，但他們在前期的實驗中發(fā)現(xiàn)，基因組上串聯(lián)重復片段間的HDR頻率非常高。

他們利用現(xiàn)象，通過將修飾的片段靶向敲入至目標位點后，人為制造這種串聯(lián)重復結構，誘導TR-HDR去實現(xiàn)片段替換。采用該技術，他們在五個基因位點上實現(xiàn)了片段替換和原位的Flag標簽蛋白的精準融合，效率最高達到了11.4%。這一技術突破將非常有助于植物學研究，并大大促進農(nóng)作物定向遺傳改良的進程。