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山東拓普生物工程有限公司

Shandong Tuopu Biol-Engineering Co.,Ltd

中 華 人 民 共 和 國(guó) 國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn)
GB4789. 3 — 2016
食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)
食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)
2016-12-23 發(fā)布 2017-06-23 實(shí)施
中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)
國(guó) 家 食 品 藥 品 監(jiān) 督 管 理 總 局
發(fā) 布
GB4789. 3 — 2016
Ⅰ
前 言
本標(biāo)準(zhǔn)代替 GB4789.3 — 2010 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸 菌群計(jì)數(shù)》、
GB / T4789. 32 — 2002 《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群的快速檢測(cè)》和 SN / T0169 — 2010 《進(jìn)出口
食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢測(cè)方法》大腸菌群計(jì)數(shù)部分。
本標(biāo)準(zhǔn)與 GB4789.
3 — 2010 相比,主要變化如下:
———增加了檢驗(yàn)原理;
———修改了適用范圍;
———修改了典型菌落的形態(tài)描述;
———修改了第二法平板菌落數(shù)的選擇;
———修改了第二法證實(shí)試驗(yàn);
———修改了第二法平板計(jì)數(shù)的報(bào)告。
GB4789. 3 — 2016
1
食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)
食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)
1  范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中大腸菌群(
Coliforms )計(jì)數(shù)的方法。
本標(biāo)準(zhǔn)第一法適用于大腸菌群含量較低的食品中大腸菌群的計(jì)數(shù);第二法適用于大腸菌群含量較
高的食品中大腸菌群的計(jì)數(shù)。
2  術(shù)語(yǔ)和定義
2. 1
大腸菌群 Coliforms
在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。
2. 2
最可能數(shù) Mostprobablenumber ; MPN
基于泊松分布的一種間接計(jì)數(shù)方法。
3  檢驗(yàn)原理
3. 1 MPN 法
MPN 法是統(tǒng)計(jì)學(xué)和微生物學(xué)結(jié)合的一種定量檢測(cè)法。待測(cè)樣品經(jīng)系列稀釋并培養(yǎng)后,根據(jù)其未
生長(zhǎng)的最低稀釋度與生長(zhǎng)的最高稀釋度,應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)概率論推算出待測(cè)樣品中大腸菌群的最大可能數(shù)。
3. 2  平板計(jì)數(shù)法
大腸菌群在固體培養(yǎng)基中發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸,在指示劑的作用下形成可計(jì)數(shù)的紅色或紫色,帶有或不帶
有沉淀環(huán)的菌落。
4  設(shè)備和材料
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下:
4. 1  恒溫培養(yǎng)箱: 36℃ ±1℃ 。
4. 2  冰箱: 2℃~5℃ 。
4. 3  恒溫水浴箱: 46℃±1℃ 。
4. 4  天平:感量 0. 1g 。
4. 5  均質(zhì)器。
4. 6  振蕩器。
4. 7  無(wú)菌吸管: 1mL (具 0. 01mL 刻度)、 10mL (具 0. 1mL 刻度)或微量移液器及吸頭。
4. 8  無(wú)菌錐形瓶:容量 500mL 。
4. 9  無(wú)菌培養(yǎng)皿:直徑 90mm 。
GB4789. 3 — 2016
2
4. 10 pH 計(jì)或
pH
比色管或精密
pH 試紙。
4. 11  菌落計(jì)數(shù)器。
5  培養(yǎng)基和試劑
5. 1  月桂基硫酸鹽胰蛋白胨( laurylsulfatetryptose , LST )肉湯:見(jiàn) A. 1 。
5. 2  煌綠乳糖膽鹽( brilliantgreenlactosebile , BGLB )肉湯:見(jiàn) A. 2 。
5. 3  結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂( violetredbileagar , VRBA ):見(jiàn) A. 3 。
5. 4  無(wú)菌磷酸鹽緩沖液:見(jiàn) A. 4 。
5. 5  無(wú)菌生理鹽水:見(jiàn) A. 5 。
5. 6 1mol
/ LNaOH 溶液:見(jiàn) A.
6 。
5. 7 1mol
/ LHCl 溶液:見(jiàn) A.
7 。
第一法 大腸菌群 MPN 計(jì)數(shù)法
6  檢驗(yàn)程序
大腸菌群 MPN 計(jì)數(shù)的檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖 1 。
圖 1  大腸菌群 MPN 計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)程序
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3
7  操作步驟
7. 1  樣品的稀釋
7. 1. 1  固體和半固體樣品:稱(chēng)取 25g 樣品,放入盛有 225mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯
內(nèi) ,
8000r / min~10000r / min 均質(zhì) 1min~2min ,或放入盛有 225mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)
菌均質(zhì)袋中,用拍擊式均質(zhì)器拍打 1min~2min ,制成 1∶10 的樣品勻液。
7. 1. 2  液體樣品:以無(wú)菌吸管吸取 25mL 樣品置盛有 225mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶
(瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠)或其他無(wú)菌容器中充分振搖或置于機(jī)械振蕩器中振搖,充分混勻,制
成 1∶10 的樣品勻液。
7. 1. 3  樣品勻液的
pH
應(yīng)在 6.
5~7. 5 之間,必要時(shí)分別用 1mol
/ LNaOH 或 1mol / LHCl 調(diào)節(jié)。
7. 1. 4  用 1mL 無(wú)菌吸管或微量移液器吸取 1∶10 樣品勻液 1mL ,沿管壁緩緩注入 9mL 磷酸鹽緩沖
液或生理鹽水的無(wú)菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面),振搖試管或換用 1 支 1mL 無(wú)
菌吸管反復(fù)吹打,使其混合均勻,制成 1∶100 的樣品勻液。
7. 1. 5  根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì),按上述操作,依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋
1 次,換用 1 支 1mL 無(wú)菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢,全過(guò)程不得超過(guò) 15min 。
7. 2  初發(fā)酵試驗(yàn)
每個(gè)樣品,選擇 3 個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液(液體樣品可以選擇原液),每個(gè)稀釋度接種 3 管
月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(
LST )肉湯,每管接種 1mL (如接種量超過(guò) 1mL ,則用雙料 LST 肉湯), 36℃±
1℃ 培養(yǎng) 24h±2h ,觀(guān)察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生, 24h±2h 產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)(證實(shí)試驗(yàn)),如未
產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至 48h±2h ,產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。
7. 3  復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)(證實(shí)試驗(yàn))
用接種環(huán)從產(chǎn)氣的 LST 肉湯管中分別取培養(yǎng)物 1 環(huán),移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯( BGLB )管中,
36℃±1℃ 培養(yǎng) 48h±2h ,觀(guān)察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者,計(jì)為大腸菌群陽(yáng)性管。
7. 4  大腸菌群最可能數(shù)( MPN )的報(bào)告
按 7.
3 確證的大腸菌群 BGLB 陽(yáng)性管數(shù),檢索 MPN 表(見(jiàn)附錄 B ),報(bào)告每 g ( mL )樣品中大腸菌群
的 MPN 值。
第二法 大腸菌群平板計(jì)數(shù)法
8  檢驗(yàn)程序
大腸菌群平板計(jì)數(shù)法的檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖 2 。
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圖 2  大腸菌群平板計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)程序
9  操作步驟
9. 1  樣品的稀釋
按 7.
1 進(jìn)行。
9. 2  平板計(jì)數(shù)
9. 2. 1  選取 2 個(gè) ~3 個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度,每個(gè)稀釋度接種 2 個(gè)無(wú)菌平皿,每皿 1mL 。同時(shí)取 1mL
生理鹽水加入無(wú)菌平皿作空白對(duì)照。
9. 2. 2  及時(shí)將 15mL~20mL 融化并恒溫至 46℃ 的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂( VRBA )約傾注于每個(gè)平
皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿,將培養(yǎng)基與樣液充分混勻,待瓊脂凝固后,再加 3mL~4mLVRBA 覆蓋平板表
層。翻轉(zhuǎn)平板,置于 36℃±1℃ 培養(yǎng) 18h~24h 。
9. 3  平板菌落數(shù)的選擇
選取菌落數(shù)在 15CFU~150CFU 之間的平板,分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落
(如菌落直徑較典型菌落小)。典型菌落為紫紅色,菌落周?chē)�有紅色的膽鹽沉淀環(huán),菌落直徑為 0.
5mm
或更大,最低稀釋度平板低于 15CFU 的記錄具體菌落數(shù)。
9. 4  證實(shí)試驗(yàn)
從 VRBA 平板上挑取 10 個(gè)不同類(lèi)型的典型和可疑菌落,少于 10 個(gè)菌落的挑取全部典型和可疑菌
落。分別移種于 BGLB 肉湯管內(nèi), 36℃±1℃ 培養(yǎng) 24h~48h ,觀(guān)察產(chǎn)氣情況。凡 BGLB 肉湯管產(chǎn)氣,
即可報(bào)告為大腸菌群陽(yáng)性。
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9. 5  大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報(bào)告
經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的試管比例乘以 9.
3 中計(jì)數(shù)的平板菌落數(shù),再乘以稀釋倍數(shù),即為每
g ( mL )樣品中大腸菌群數(shù)。例: 10
-4 樣品稀釋液 1mL ,在
VRBA 平板上有 100 個(gè)典型和可疑菌落,挑
取其中 10 個(gè)接種 BGLB 肉湯管,證實(shí)有 6 個(gè)陽(yáng)性管,則該樣品的大腸菌群數(shù)為:
100×6 / 10×10
4 /
g ( mL ) =
6. 0×10
5 CFU
/ g ( mL )。若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無(wú)菌落生長(zhǎng),則以小于 1 乘以最低稀
釋倍數(shù)計(jì)算。
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附 錄 A
培養(yǎng)基和試劑
A. 1  月桂基硫酸鹽胰蛋白胨( LST )肉湯
A. 1. 1  成分
胰蛋白胨或胰酪胨
20. 0g
氯化鈉
5. 0g
乳糖
5. 0g
磷酸氫二鉀( K
2 HPO 4 ) 2. 75g
磷酸二氫鉀( KH 2 PO 4 )
2. 75g
月桂基硫酸鈉
0. 1g
蒸餾水
1000mL
A. 1. 2  制法
將上述成分溶解于蒸餾水中,調(diào)節(jié)
pH
至 6.
8±0. 2 。分裝到有玻璃小倒管的試管中,每管 10mL 。
121℃ 高壓滅菌 15min 。
A. 2  煌綠乳糖膽鹽( BGLB )肉湯
A. 2. 1  成分
蛋白胨
10. 0g
乳糖
10. 0g
牛膽粉( oxgall 或 oxbile )溶液
200mL
0. 1% 煌綠水溶液 13. 3mL
蒸餾水
800mL
A. 2. 2  制法
將蛋白胨、乳糖溶于約 500mL 蒸餾水中,加入牛膽粉溶液 200mL (將 20.
0g 脫水牛膽粉溶于
200mL 蒸餾水中,調(diào)節(jié)
pH
至 7.
0~7. 5 ),用蒸餾水稀釋到 975mL ,調(diào)節(jié)
pH
至 7.
2±0. 1 ,再加入 0. 1%
煌綠水溶液 13.
3mL ,用蒸餾水補(bǔ)足到 1000mL ,用棉花過(guò)濾后,分裝到有玻璃小倒管的試管中,每管
10mL 。 121℃ 高壓滅菌 15min 。
A. 3  結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂( VRBA )
A. 3. 1  成分
蛋白胨
7. 0g
酵母膏
3. 0g
乳糖
10. 0g
GB4789. 3 — 2016
7
氯化鈉
5. 0g
膽鹽或 3 號(hào)膽鹽
1. 5g
中性紅
0. 03g
結(jié)晶紫
0. 002g
瓊脂
15g~18g
蒸餾水
1000mL
A. 3. 2  制法
將上述成分溶于蒸餾水中,靜置幾分鐘,充分?jǐn)嚢?調(diào)節(jié)
pH
至 7.
4±0. 1 。煮沸 2min ,將培養(yǎng)基融
化并恒溫至 45℃~50℃ 傾注平板。使用前臨時(shí)制備,不得超過(guò) 3h 。
A. 4  磷酸鹽緩沖液
A. 4. 1  成分
磷酸二氫鉀( KH 2 PO 4 )
34. 0g
蒸餾水
500mL
A. 4. 2  制法
貯存液:稱(chēng)取 34.
0g 的磷酸二氫鉀溶于 500mL 蒸餾水中,用大約 175mL
的 1mol / L 氫氧化鈉溶
液調(diào)節(jié)
pH
至 7.
2±0. 2 ,用蒸餾水稀釋至 1000mL 后貯存于冰箱。稀釋液:取貯存液 1. 25mL ,用蒸餾
水稀釋至 1000mL ,分裝于適宜容器中, 121℃ 高壓滅菌 15min 。
A. 5  無(wú)菌生理鹽水
A. 5. 1  成分
氯化鈉
8. 5g
蒸餾水
1000mL
A. 5. 2  制法
稱(chēng)取 8.
5g 氯化鈉溶于 1000mL
蒸餾水中, 121℃ 高壓滅菌 15min 。
A. 6 1mol
/ LNaOH 溶液
A. 6. 1  成分
NaOH 40. 0g
蒸餾水
1000mL
A. 6. 2  制法
稱(chēng)取 40g 氫氧化鈉溶于 1000mL 無(wú)菌蒸餾水中。
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A. 7 1mol
/ LHCl 溶液
A. 7. 1  成分
HCl 90mL
蒸餾水
1000mL
A. 7. 2  制法
移取濃鹽酸 90mL ,用無(wú)菌蒸餾水稀釋至 1000mL 。
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附 錄 B
大腸菌群最可能數(shù)( MPN )檢索表
B. 1  大腸菌群最可能數(shù)( MPN )檢索表
每 g ( mL )檢樣中大腸菌群最可能數(shù)( MPN )的檢索見(jiàn)表 B.
1 。
表 B.
1  大腸菌群最可能數(shù)( MPN )檢索表
陽(yáng)性管數(shù)
0. 10 0. 01 0. 001
MPN
95% 可信限
下限 上限
陽(yáng)性管數(shù)
0. 10 0. 01 0. 001
MPN
95% 可信限
下限 上限
0 0 0 <3. 0
—
9. 5 2 2 0 21 4. 5 42
0 0 1 3. 0 0. 15 9. 6 2 2 1 28 8. 7 94
0 1 0 3. 0 0. 15 11 2 2 2 35 8. 7 94
0 1 1 6. 1 1. 2 18 2 3 0 29 8. 7 94
0 2 0 6. 2 1. 2 18 2 3 1 36 8. 7 94
0 3 0 9. 4 3. 6 38 3 0 0 23 4. 6 94
1 0 0 3. 6 0. 17 18 3 0 1 38 8. 7 110
1 0 1 7. 2 1. 3 18 3 0 2 64 17 180
1 0 2 11 3. 6 38 3 1 0 43 9 180
1 1 0 7. 4 1. 3 20 3 1 1 75 17 200
1 1 1 11 3. 6 38 3 1 2 120 37 420
1 2 0 11 3. 6 42 3 1 3 160 40 420
1 2 1 15 4. 5 42 3 2 0 93 18 420
1 3 0 16 4. 5 42 3 2 1 150 37 420
2 0 0 9. 2 1. 4 38 3 2 2 210 40 430
2 0 1 14 3. 6 42 3 2 3 290 90 1000
2 0 2 20 4. 5 42 3 3 0 240 42 1000
2 1 0 15 3. 7 42 3 3 1 460 90 2000
2 1 1 20 4. 5 42 3 3 2 1100 180 4100
2 1 2 27 8. 7 94 3 3 3 >1100 420
—
注 1 :本表采用 3 個(gè)稀釋度[ 0. 1g ( mL )、 0. 01g ( mL )、 0. 001g ( mL )],每個(gè)稀釋度接種 3 管。
注 2 :表內(nèi)所列檢樣量如改用 1g ( mL )、 0.
1g ( mL )和 0.
01g ( mL )時(shí),表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低 10 倍;如改用 0.
01g
( mL )、
0. 001g ( mL )和 0. 0001g ( mL )時(shí),則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增高 10 倍,其余類(lèi)推。