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農(nóng)桿菌T-DNA介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)高效DNA定向插入
作者：朱漢斌         來(lái)源：中國(guó)科學(xué)報(bào)
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華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院副教授胡宇飛課題組在國(guó)家自然科學(xué)重點(diǎn)基金等項(xiàng)目的資助下，在擬南芥中利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移DNA（T-DNA）的高效定點(diǎn)插入，并開(kāi)發(fā)出兩種應(yīng)用。近日，相關(guān)成果發(fā)表于《植物雜志》（Plant Journal）。
位點(diǎn)特異性DNA插入（site-specific DNA insertion）是作物育種和基因功能分析的重要工具，可以將功能性元件插入特定基因組位點(diǎn)，并可以避免插入基因在染色體不同位置所帶來(lái)的表達(dá)差異。在過(guò)去幾十年里，許多努力未能實(shí)現(xiàn)令人滿(mǎn)意的效率。
傳統(tǒng)的位點(diǎn)特異性DNA插入方法基于同源重組修復(fù)機(jī)制，然而，植物細(xì)胞中同源重組修復(fù)的低活性使得需要多個(gè)世代，篩選大量后代，因而低效。與同源重組修復(fù)介導(dǎo)的插入低效相比，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA整合效率高，是植物遺傳工程的主要手段。然而，T-DNA整合依賴(lài)非同源末端連接途徑，在植物基因組中的插入位點(diǎn)具有隨機(jī)性。
該研究開(kāi)發(fā)了一種CRISPR/Cas9介導(dǎo)的擬南芥靶向T-DNA插入的方法。該方法比同源重組修復(fù)介導(dǎo)的方法更快速、高效，并以此開(kāi)發(fā)了基因激活和雄性生殖細(xì)胞特異性基因標(biāo)記兩種應(yīng)用�；�因激活通過(guò)在T-DNA的LB端設(shè)置CaMV35S啟動(dòng)子，定點(diǎn)插入激活特定的下游基因。利用該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了FT和MYB26的激活，顯著增加了轉(zhuǎn)錄表達(dá)，分別導(dǎo)致早花和花藥內(nèi)壁次生壁增厚模式的改變。
雄性生殖細(xì)胞特異性基因標(biāo)記的T-DNA中包含兩個(gè)報(bào)告基因，即NeoR和MGH3::mCherry，有助于創(chuàng)建定點(diǎn)插入突變體，簡(jiǎn)化突變等位基因的遺傳分析，并可對(duì)受精過(guò)程的生殖細(xì)胞進(jìn)行活體追蹤。該研究成功地將該系統(tǒng)應(yīng)用于靶向精細(xì)胞特異表達(dá)，參與精卵識(shí)別的基因GEX2。
相關(guān)論文信息：https://doi.org/10.1111/tpj.70104
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