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農(nóng)桿菌T-DNA介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)高效DNA定向插入
[所屬分類(lèi):行業(yè)動(dòng)態(tài)] [發(fā)布時(shí)間:2025-4-8] [發(fā)布人:楊曉燕] [閱讀次數(shù):] [返回]
農(nóng)桿菌T-DNA介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)高效DNA定向插入
作者:朱漢斌 來(lái)源:中國(guó)科學(xué)報(bào)
山東拓普生物工程有限公司 http://www.jlkcpj.cn
華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院副教授胡宇飛課題組在國(guó)家自然科學(xué)重點(diǎn)基金等項(xiàng)目的資助下,在擬南芥中利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移DNA(T-DNA)的高效定點(diǎn)插入,并開(kāi)發(fā)出兩種應(yīng)用。近日,相關(guān)成果發(fā)表于《植物雜志》(Plant Journal)。
位點(diǎn)特異性DNA插入(site-specific DNA insertion)是作物育種和基因功能分析的重要工具,可以將功能性元件插入特定基因組位點(diǎn),并可以避免插入基因在染色體不同位置所帶來(lái)的表達(dá)差異。在過(guò)去幾十年里,許多努力未能實(shí)現(xiàn)令人滿(mǎn)意的效率。
傳統(tǒng)的位點(diǎn)特異性DNA插入方法基于同源重組修復(fù)機(jī)制,然而,植物細(xì)胞中同源重組修復(fù)的低活性使得需要多個(gè)世代,篩選大量后代,因而低效。與同源重組修復(fù)介導(dǎo)的插入低效相比,農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA整合效率高,是植物遺傳工程的主要手段。然而,T-DNA整合依賴(lài)非同源末端連接途徑,在植物基因組中的插入位點(diǎn)具有隨機(jī)性。
該研究開(kāi)發(fā)了一種CRISPR/Cas9介導(dǎo)的擬南芥靶向T-DNA插入的方法。該方法比同源重組修復(fù)介導(dǎo)的方法更快速、高效,并以此開(kāi)發(fā)了基因激活和雄性生殖細(xì)胞特異性基因標(biāo)記兩種應(yīng)用;蚣せ钔ㄟ^(guò)在T-DNA的LB端設(shè)置CaMV35S啟動(dòng)子,定點(diǎn)插入激活特定的下游基因。利用該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了FT和MYB26的激活,顯著增加了轉(zhuǎn)錄表達(dá),分別導(dǎo)致早花和花藥內(nèi)壁次生壁增厚模式的改變。
雄性生殖細(xì)胞特異性基因標(biāo)記的T-DNA中包含兩個(gè)報(bào)告基因,即NeoR和MGH3::mCherry,有助于創(chuàng)建定點(diǎn)插入突變體,簡(jiǎn)化突變等位基因的遺傳分析,并可對(duì)受精過(guò)程的生殖細(xì)胞進(jìn)行活體追蹤。該研究成功地將該系統(tǒng)應(yīng)用于靶向精細(xì)胞特異表達(dá),參與精卵識(shí)別的基因GEX2。
相關(guān)論文信息:https://doi.org/10.1111/tpj.70104
(本文內(nèi)容來(lái)源于網(wǎng)絡(luò),版權(quán)歸原作者所有,如有侵權(quán)可后臺(tái)聯(lián)系刪除。)
作者:朱漢斌 來(lái)源:中國(guó)科學(xué)報(bào)
山東拓普生物工程有限公司 http://www.jlkcpj.cn
華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院副教授胡宇飛課題組在國(guó)家自然科學(xué)重點(diǎn)基金等項(xiàng)目的資助下,在擬南芥中利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移DNA(T-DNA)的高效定點(diǎn)插入,并開(kāi)發(fā)出兩種應(yīng)用。近日,相關(guān)成果發(fā)表于《植物雜志》(Plant Journal)。
位點(diǎn)特異性DNA插入(site-specific DNA insertion)是作物育種和基因功能分析的重要工具,可以將功能性元件插入特定基因組位點(diǎn),并可以避免插入基因在染色體不同位置所帶來(lái)的表達(dá)差異。在過(guò)去幾十年里,許多努力未能實(shí)現(xiàn)令人滿(mǎn)意的效率。
傳統(tǒng)的位點(diǎn)特異性DNA插入方法基于同源重組修復(fù)機(jī)制,然而,植物細(xì)胞中同源重組修復(fù)的低活性使得需要多個(gè)世代,篩選大量后代,因而低效。與同源重組修復(fù)介導(dǎo)的插入低效相比,農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA整合效率高,是植物遺傳工程的主要手段。然而,T-DNA整合依賴(lài)非同源末端連接途徑,在植物基因組中的插入位點(diǎn)具有隨機(jī)性。
該研究開(kāi)發(fā)了一種CRISPR/Cas9介導(dǎo)的擬南芥靶向T-DNA插入的方法。該方法比同源重組修復(fù)介導(dǎo)的方法更快速、高效,并以此開(kāi)發(fā)了基因激活和雄性生殖細(xì)胞特異性基因標(biāo)記兩種應(yīng)用;蚣せ钔ㄟ^(guò)在T-DNA的LB端設(shè)置CaMV35S啟動(dòng)子,定點(diǎn)插入激活特定的下游基因。利用該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了FT和MYB26的激活,顯著增加了轉(zhuǎn)錄表達(dá),分別導(dǎo)致早花和花藥內(nèi)壁次生壁增厚模式的改變。
雄性生殖細(xì)胞特異性基因標(biāo)記的T-DNA中包含兩個(gè)報(bào)告基因,即NeoR和MGH3::mCherry,有助于創(chuàng)建定點(diǎn)插入突變體,簡(jiǎn)化突變等位基因的遺傳分析,并可對(duì)受精過(guò)程的生殖細(xì)胞進(jìn)行活體追蹤。該研究成功地將該系統(tǒng)應(yīng)用于靶向精細(xì)胞特異表達(dá),參與精卵識(shí)別的基因GEX2。
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